Calcein AM

 

نام محصول	گربهخیر.	مشخصات..
Calcein AM	G{0}}.1ML	0.1 میلی لیتر

 

 

Calcein AM (Calcein acetoxymethyl ester)، بر پایه Calcein با معرفی گروه استوکسی متیل استر (AM) ساخته شده است که باعث افزایش آبگریزی می شود، بنابراین می تواند به راحتی به غشای سلول های زنده نفوذ کند. Calcein AM خود یک ترکیب غیر فلورسنت و آبگریز قابل نفوذ به سلول است که پس از ورود به سلول توسط استرازهای درون زا در سلول هیدرولیز می شود تا مولکول قطبی با بار منفی قوی کلسین تولید کند که نمی تواند به غشای سلول نفوذ کند. در داخل سلول حفظ می شود، در حالی که کلسین (حداکثر طول موج تحریک: 494 nm؛ حداکثر طول موج انتشار: 517 نانومتر) می تواند فلورسانس سبز قوی ساطع کند. در مقایسه با سایر پروب‌های مشابه (مانند BCECF AM و CFDA AM)، Calcein AM در حال حاضر یکی از ایده‌آل‌ترین پروب‌های فلورسنت برای رنگ‌آمیزی سلول‌های زنده است، زیرا سمیت سلولی بسیار پایینی دارد، عملاً هیچ تأثیری بر عملکردهای سلولی مانند تکثیر سلولی یا کموتاکسی لنفوسیتی ندارد. و حساسیت pH پایین

به دلیل عدم وجود استراز در سلول های مرده، Calcein AM تنها برای آزمایش زنده ماندن و برچسب زدن کوتاه مدت سلول های زنده استفاده می شود. رنگ اسید نوکلئیک فلورسنت قرمز پروپیدیوم یدید (PI) به غشای سلولی سلول‌های زنده نفوذ نمی‌کند، از طریق ناحیه بی‌نظم غشای سلول مرده به هسته می‌رود و خود را در مارپیچ دوگانه DNA سلول جاسازی می‌کند تا فلورسانس قرمز تولید کند. تحریک: 535 نانومتر، انتشار: 617 نانومتر)، بنابراین PI فقط مرده است سلول ها Calcein AM اغلب در ترکیب با پروپیدیوم یدید (PI) برای رنگ آمیزی فلورسانس دوگانه سلول های زنده و مرده استفاده می شود. از آنجایی که هر دو کلسین و PI-DNA را می توان در 490 نانومتر برانگیخت، سلول های زنده و مرده را می توان به طور همزمان با میکروسکوپ فلورسانس مشاهده کرد. با تحریک 545 نانومتری، فقط سلول های مرده را می توان مشاهده کرد.

Calcein AM را می توان در اکثر سلول های پستانداران استفاده کرد. نشان داده شده است که Calcein AM را می توان در برخی از سلول های گیاهی مانند سلول های لبه مانند ریشه آرابیدوپسیس و برخی مخمرها مانند Pichia anomala و Saccharomyces cerevisiae استفاده کرد. برخی انگل‌ها مانند لیشمانیا به دلیل اجزای غشای سلولی نمی‌توانند وارد سلول‌های زنده شوند، اما Calcein AM می‌تواند در مراحل اولیه آپوپتوز وارد سلول‌های انگل شود و بنابراین همراه با PI برای تشخیص انگل‌ها در مراحل اولیه آپوپتوز استفاده می‌شود. Calcein AM برای استفاده بر روی قارچ ها و باکتری ها مناسب نیست زیرا آنها دارای دیواره های سلولی هستند که از ورود Calcein AM به سلول ها جلوگیری می کند.

کلسین خود یک نشانگر کمپلکس شدن فلز است و سیگنال فلورسنت هنگامی که با یون های فلزی مانند Co کمپلکس می شود خاموش می شود.²⁺، نی²⁺مس²⁺، Fe³⁺، و منگنز²⁺در pH فیزیولوژیکی، Calcein AM را نیز به یک کاوشگر فلورسنت سبز تبدیل می کند که می تواند برای تعیین منافذ انتقال نفوذپذیری میتوکندری استفاده شود.

این محصول، Calcein AM، خلوص بالایی دارد و در DMSO بی آب با غلظت 2 میلی مولار حل شده است. غلظت نهایی رایج کلسین AM 0 است.1-5.0 میکرومولار. برای به دست آوردن نتیجه مطلوب تر، لطفاً غلظت نهایی کلسین را با توجه به نوع سلول ها و وضعیت واقعی آزمایش تنظیم کنید.

 

 

مدرک -20 برای ذخیره سازی و حمل و نقل، اعتبار به مدت 12 ماه.

 

 

جزء	G1728-0.1ML
Calcein AM	0.1 میلی لیتر
دستی	1 عدد

 

 

محلول کار رنگ آمیزی کلسین AM تهیه شد:

محصول را با یک بافر مناسب، مانند محیط کشت بدون سرم، HBSS (G4203)، یا PBS (G4202) رقیق کنید تا محلول کار رنگ آمیزی Calcein AM با غلظت آماده شود. از 0.1-5.0 میکرومولار.

توجه: غلظت نهایی Calcein AM توصیه می شود که به طور مناسب با توجه به نوع سلول و واقعیت آزمایشی تنظیم شود.

 

رویه ها

1. سنجش میکروسکوپ فلورسانس یا روش زیموگرافی فلورسانس برای سلول‌های سوسپانسیون:

الف) سلول ها پس از تیمارهای معین بر اساس طرح آزمایشی شمارش شدند. سلول های مناسب را بردارید و آنها را در 250×g به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ کنید، مایع رویی را دور بیندازید و حجم مناسب محلول رنگ آمیزی Calcein AM را اضافه کنید تا تراکم سلول حدود 1×10 شود.⁶/ml.

ب) سلولها را در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30-45 دقیقه انکوبه کنید، زمان انکوباسیون بهینه برای سلولهای مختلف متفاوت است. 30 دقیقه را به عنوان زمان انکوباسیون اولیه در نظر بگیرید و آن را با توجه به شرایط آزمایشی خاص بهینه کنید تا نتایج تشخیص ایده آل تری به دست آورید.

ج) در پایان انکوباسیون، در 250×g به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ کنید، مایع رویی را آسپیره کنید و با افزودن محیط کشت 37 درجه سانتیگراد که از قبل گرم شده بود، سلولها را به آرامی معلق کنید.

د) مرحله c را دو یا چند بار تکرار کنید تا به اندازه کافی بشویید تا محلول لکه‌دار از بین برود.

ه) محیط کشت تازه 37 درجه سانتی گراد را جایگزین کنید و در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه دیگر دور از نور انکوبه کنید تا اطمینان حاصل شود که استرازهای داخل سلولی به اندازه کافی کلسین AM را برای تولید کلسین با فلورسانس سبز هیدرولیز می کنند.

و) سلول ها در دمای 250×g به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شدند، بیشتر محیط کشت آسپیره شد و سلول ها با محیط کشت باقی مانده مجدداً معلق شدند و آغشته شدند و سپس در زیر میکروسکوپ فلورسانس مشاهده شدند یا توسط فلورسانس تشخیص داده شدند. زیموگرافی. حداکثر طول موج تحریک کلسین 494 نانومتر و حداکثر طول موج انتشار 514 نانومتر است. در صورت لزوم، رنگ‌آمیزی مجدد فلورسانس دیگر می‌تواند انجام شود و از کل فرآیند باید با عملیات سبک اجتناب شود.

 

2. سنجش میکروسکوپ فلورسانس سلول‌های چسبنده یا سنجش برچسب‌گذاری آنزیم فلورسانس:

الف) سلول ها بر روی ظروف پتری، صفحات کشت سلولی چند چاهی یا خزنده های سلولی تلقیح شدند و طبق طرح آزمایشی به روش های خاصی تحت درمان قرار گرفتند.

ب) محلول کشت را آسپیره کنید و سلولها را 1-2 بار با PBS بشویید.

ج) حجم مناسبی از محلول رنگ آمیزی کلسین AM اضافه کنید و به آرامی تکان دهید تا رنگ به طور یکنواخت تمام سلول ها را بپوشاند. به طور کلی، حجم 96-ورق چاه 100 اول در هر چاه، 24-ورق چاه 250 اول در هر چاه، 12-ورق چاه 500 اول در هر چاه است، و 6- بشقاب چاه 1 میلی لیتر در هر چاه است.

د) در دمای 37 درجه سانتیگراد برای 30-45 دقیقه جوجه کشی کنید، زمان انکوباسیون بهینه برای سلول های مختلف متفاوت است. 30 دقیقه به عنوان زمان انکوباسیون اولیه در نظر بگیرید و زمان انکوباسیون را با توجه به سلول های استفاده شده بهینه کنید تا اثر رنگ آمیزی ایده آل تری داشته باشید.

ه) در پایان انکوباسیون، محیط کشت با محیط کشت تازه از قبل گرم شده در دمای 37 درجه سانتیگراد جایگزین شد و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه دیگر دور از نور انکوبه شد تا اطمینان حاصل شود که استراز داخل سلولی به اندازه کافی کلسین AM را هیدرولیز می کند تا کلسین با فلورسانس سبز تولید کند. .

و) مایع کشت را آسپیره کنید، 2-3 بار با PBS بشویید، و سپس مایع کشت سلولی بدون سرم را اضافه کنید، می‌توان آن را زیر میکروسکوپ فلورسانس مشاهده کرد یا با نشانگر آنزیم فلورسنت تشخیص داد. کلسین دارای حداکثر طول موج تحریک 494 است. نانومتر و حداکثر طول موج انتشار 514 نانومتر، و می‌توان آن را بیشتر با سایر موارد رنگ آمیزی کرد. در صورت تمایل فلورسنت، کل فرآیند را از نور دور نگه می دارد.

 

3. سنجش فلوسیتومتری:

الف) پس از هضم تریپسین سلول‌های چسبنده، سلول‌ها را مجدداً در محیط کشت معلق کنید، سلول‌ها را برای استفاده مستقیم معلق کنید، شمارش کنید، مقدار مناسبی از سلول‌ها را در 250×g به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ کنید، مایع رویی را دور بریزید و یک ماده مناسب اضافه کنید. حجم محلول کار رنگ آمیزی کلسین AM به طوری که سلول ها یک سوسپانسیون تک سلولی باشند و چگالی سلول ها تقریباً 106×1 بر میلی لیتر باشد. با حجم 1 میلی لیتر برای هر نمونه. توجه: لازم است یک نمونه بافر از سلول ها برای استفاده به عنوان کنترل منفی در سنجش فلوسیتومتری تهیه شود. کنترل منفی برای سنجش فلوسیتومتری، و مطلوب است که این بافر همان بافر مورد استفاده برای تهیه محلول کاری رنگ آمیزی Calcein AM باشد.

ب) به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد دور از نور انکوبه کنید.

ج) پس از اتمام انکوباسیون، سلول ها با سانتریفیوژ در 250 × گرم به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق جمع آوری شدند. به ازای هر نمونه 1 میلی لیتر بافر اضافه کنید، به آرامی مجدداً معلق کنید و سلول ها را با سانتریفیوژ در 250×g به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق جمع آوری کنید. توجه: این مرحله رنگ اضافی و معرف هایی را که ممکن است باعث خاموش شدن فلورسانس شوند، حذف می کند.

د) سلول ها را با 400 میکرولیتر بافر معلق کنید. در صورت لزوم می توان رنگ آمیزی بیشتر را نیز انجام داد. توجه داشته باشید که کل فرآیند باید دور از نور انجام شود. پس از رنگ‌آمیزی، نمونه‌ها روی یخ قرار می‌گیرند و می‌توان آن‌ها را در عرض 1 ساعت از نظر فلوسایتومتری شناسایی و آنالیز کرد.

ه) توجه داشته باشید که برای تنظیم کنترل منفی فلوسایتومتر از نمونه های سلولی فقط بافر و رنگ نشده استفاده شد. Calcein دارای حداکثر طول موج تحریک 494 نانومتر و حداکثر طول موج انتشار 514 نانومتر است.

 

 

1. همه رنگ های فلورسنت دارای مشکلات خاموش شدن هستند و باید مراقب بود تا حد امکان از نور جلوگیری شود تا سرعت خاموش شدن فلورسانس کاهش یابد.

2. Calcein AM به رطوبت بسیار حساس است و در محیط های مرطوب تمایل به تجزیه دارد، بنابراین محلول Calcein AM باید پس از هر بار برداشت با درپوش محکم بسته شود. توصیه می شود در بسته بندی های جداگانه بسته بندی شده و طبق دوز واحد نگهداری شود. از نوک پیپت های حاوی آب استفاده نکنید.

3. از آنجایی که Calcein AM در محلول های آبی مانند PBS پایدار نیست، محلول کار رنگ آمیزی باید هم اکنون تهیه و استفاده شود.

4. سرم و فنل رد در محیط کشت بر روی رنگ آمیزی کلسین AM اثر دارد و توصیه می شود قبل از افزودن محلول کاری کلسین AM، سلول ها به اندازه کافی شسته شوند.

5. سلول های نشاندار شده با Calcein AM با فلورسانس یکنواخت انتخاب خوبی برای ردیابی سلولی و رنگ آمیزی سیتوپلاسمی عمومی است، با این حال، به هیچ چیز متصل نمی شود و ممکن است به طور فعال در عرض چند ساعت از سلول خارج شود و کلسین در سلول های زنده باقی بماند. بستگی به ویژگی های ذاتی نوع سلول و شرایط کشت دارد.

6. رنگ آمیزی Calcein AM نباید به دنبال تثبیت آلدئید باشد در غیر این صورت کلسین در طول تثبیت از بین می رود. علاوه بر این، هرگونه اختلال در غشای پلاسمایی (به عنوان مثال، مواد رسوب زدایی یا درمان تریپسین) منجر به نشت رنگ از سلول ها می شود.

7. اگر Calcein AM برای ورود به سلول ها مشکل داشته باشد، می توان از یک سورفکتانت مانند Pluronic F127 استفاده کرد. همچنین می توان از محلول Calcein AM با غلظت 1/10 به جای محیط کشت استفاده کرد.

8. این محصول به استفاده از تحقیقات علمی توسط متخصصان محدود می شود و نباید برای روش های تشخیصی یا درمانی، غذا یا دارو یا نگهداری در یک محل سکونت معمولی استفاده شود.

9. برای ایمنی و سلامت خود، لطفا از کت آزمایشگاه و دستکش یکبار مصرف استفاده کنید.

 

فقط برای استفاده تحقیقاتی!

 

 

تگ های محبوب: calcein am، چین calcein am تولید کنندگان، تامین کنندگان، کارخانه