کیت رسوب ایمنی (پروتئین A/G آگاروز)

IP یا Co-IP یک تکنیک تجربی رایج برای مطالعه برهمکنش‌های پروتئین یا پروتئین-پروتئین (PPIs) با استفاده از آنتی‌بادی‌های خاص و محیطی است که به آنتی‌بادی‌ها متصل می‌شود (مثلاً پروتئین A/G آگاروز یا پروتئین A/G Magrose)، یا مستقیماً با استفاده از یک محیط با آنتی بادی های خاص (مانند آگارز یا دانه های مغناطیسی) همراه شده و سپس مجتمع های آنتی ژن-آنتی بادی از نمونه های پروتئینی پیچیده جدا می شود. سانتریفیوژ یا نیروی مغناطیسی، که متعاقباً می تواند برای وسترن بلات یا طیف سنجی جرمی استفاده شود. پروتئین G یک پروتئین اتصال دهنده ایمونوگلوبولین است که توسط باکتری های استرپتوکوک نوع C یا G بیان می شود. پروتئین A یک پروتئین سطح دیواره سلولی است که در استافیلوکوکوس اورئوس با وزن مولکولی 42 کیلو دالتون یافت می شود. پروتئین A و پروتئین G از نظر عملکردی مشابه هستند و می توانند به طور خاص به ایمونوگلوبولین پستانداران (Ig) متصل شوند. پروتئین نوترکیب A و G با تغییرات مناسب متصل به آگارز می تواند برای رسوب ایمنی یا خالص سازی آنتی بادی استفاده شود. آگارز پروتئین A برای رسوب ایمنی IgG1، IgG2، IgG4، IgG2a، IgG2b موش مناسب است، در حالی که دانه های پروتئین G آگارز برای رسوب ایمنی انسان IgG1، IgG2، IgG3، IgG2، IgG2، IgG2، IgG2، IgG2، IgG2، IgG2، IgG2، IgG2، IgG2، IgG2، IgG2، IgG2، IgG2، IgG2. آنتی بادی های پلی کلونال IgG3، IgG1، IgG2a، IgG2b، IgG2c موش صحرایی. (برای اطلاعات خاص به جدول I مراجعه کنید)

این محصول از آگارز با برچسب پروتئین A/G خود ساخته و تولید شده استفاده می کند، در مقایسه با محصولات مشابه در بازار، این محصول آنتی بادی ها را موثرتر متصل می کند و نرخ اتصال غیر اختصاصی پایین تری دارد، همراه با بافر بهینه شده، می تواند راحت باشد. و کارآمد برای آزمایش های immunoprecipitation. می توان آن را به طور گسترده ای در جداسازی و خالص سازی پروتئین های هدف در نمونه هایی مانند لیزات سلولی، مایع رویی ترشح سلولی، سرم، آسیت و غیره استفاده کرد. این کیت دو روش شستشو (شستشوی دناتوره و شستشوی اسیدی) را برای شستشوی پروتئین هدف ارائه می دهد، به خصوص شستشوی اسیدی حاوی زنجیره های سبک و سنگین آنتی بادی نخواهد بود که می تواند به طور موثر مشکل تداخل سنگین و سبک آنتی بادی را حل کند. زنجیره‌ای در آزمایش‌های رسوب ایمنی و بلات پروتئینی

کشتی با یخ مرطوب؛ بافر بارگیری 5X SDS-PAGE (کاهش یافته) باید در-20 درجه و بقیه در 2-8 درجه به مدت 12 ماه ذخیره شود.

1. آماده سازی کیت

الف) به جدول زیر مراجعه کنید، معرفهای مربوطه را با نسبت 100-500 میکرولیتر لیزات در هر نمونه تهیه کنید.

ب) تهیه IP lysate حاوی بازدارنده پروتئاز: به جدول بالا مراجعه کنید، از {{0}} میکرولیتر IP lysate حاوی بازدارنده پروتئاز در هر 0.5-1 میلیون سلول برای لیز استفاده کنید. لیزات IP را با 50 برابر مهارکننده پروتئاز کوکتل (G{4}}UL توصیه می‌شود) به نسبت 50:1 مخلوط کنید، برای مثال، 20 میکرولیتر مهارکننده پروتئاز کوکتل 50 برابر را به 1 میلی‌لیتر لیزات IP، سپس 1 میلی‌لیتر از آن اضافه کنید. لیز IP حاوی مهارکننده پروتئاز به دست خواهد آمد. لیز IP آماده شده حاوی بازدارنده باید در حمام یخ یا در دمای 4 درجه قرار گیرد.

ج) توجه: اگر پروتئین هدف رسوب ایمنی شامل فسفوریلاسیون یا اصلاح استیلاسیون باشد، باید مهارکننده فسفاتاز یا بازدارنده داستیلاز اضافه شود (خود تهیه شود). مهارکننده حاوی لیز IP باید قبل از استفاده تهیه شود و نباید منجمد شود و برای استفاده بعدی نگهداری شود.

د) تهیه 1×TBS: بافر 10×TBS را با آب فوق خالص تا 1×TBS رقیق کنید. برای مثال، 1 میلی‌لیتر بافر 10×TBS را به 9 میلی‌لیتر آب فوق‌العاده خالص اضافه کنید که پس از مخلوط کردن خوب، بافر 1×TBS است.

ه) تهیه بافر بارگیری 1 برابری SDS-PAGE (کاهش شده): مقدار مناسبی از بافر بارگیری 5 برابری SDS-PAGE (کاهش یافته) 5 بار با آب فوق خالص رقیق شد تا 1 برابر بافر بارگیری SDS-PAGE (کاهش یافته) ساخته شود. برای مثال، 0.2 میلی‌لیتر بافر پروتئینی 5 برابری (کاهش‌شده) را با 0}.8 میلی‌لیتر آب فوق‌العاده خالص مخلوط کنید که 1 برابر بافر بارگیری SDS-PAGE (کاهش‌شده) است.

2. آماده سازی نمونه آنتی ژن

آزمایش‌های رسوب ایمنی یا رسوب ایمنی باید بلافاصله پس از لیز شدن نمونه‌ها انجام شود، در غیر این صورت، نمونه‌ها را می‌توان در دمای -20 درجه یا -80 درجه در یخچال نگهداری کرد، اما انجماد و ذوب شدن ممکن است بر تعاملات پروتئین-پروتئین تأثیر بگذارد. تمام مراحل لیز نمونه باید در یک حمام یخ یا در دمای 4 درجه انجام شود تا تخریب پروتئین به حداقل برسد و مقدار مشخصی از نمونه باید به عنوان ورودی یا کل پس از آماده شدن نمونه برای تشخیص بعدی گرفته شود. وسترن بلات.

برای نمونه های بافت:

الف) بافت ها باید با PBS قبل از سرد شدن (توصیه G4202) شسته شوند تا خون اضافی به طور کامل خارج شود. در هموژنایزر روی یخ وزن کرده و به قطعات کوچک خرد کنید.

ب) لیزات IP حاوی مهارکننده پروتئاز را به نسبت 100-200 میکرولیتر به ازای 10-20 میلی گرم بافت اضافه کنید، یا در صورت نیاز به غلظت های بالاتر پروتئین، مقدار لیزات IP را کاهش دهید.

ج) با هموژنایزر شیشه ای یا هموژنایزر دستی همگن کنید، یا از آسیاب با دمای پایین KZ-III-F خودمان برای آسیاب کامل استفاده کنید.

د) هموژن به یک لوله سانتریفیوژ 1.5 میلی لیتری منتقل شد، تکان داده شد و مخلوط شد و به مدت 30 دقیقه در یخ قرار گرفت و هر 10 دقیقه یکبار با پیپت دمیده شد تا از لیز کامل سلول های بافت اطمینان حاصل شود.

ه) سانتریفیوژ در 12،000 xg به مدت 5 دقیقه در 4 درجه، رسوب را دور بیندازید و مایع رویی را برای آزمایش‌های ایمونوفیلاسیون یا رسوب ایمنی بعدی خارج کنید.

برای نمونه های سلول چسبنده:

الف) در صورت لزوم، سلول ها را می توان 2-3 بار با PBS شستشو داد، در آخرین بار مایع باقی مانده را کاملاً جذب کرد.

ب) سلول ها را با خراش دادن سلولی یا هضم تریپسین سلول ها را خراش دهید تا کاملاً معلق شوند، آنها را در یک لوله سانتریفیوژ 1.5 میلی لیتری جمع کنید و در دمای 1،{3}} xg به مدت 5 دقیقه در 4 درجه سانتریفیوژ کنید، مایع رویی را دور بریزید تا رسوب سلولی را جمع آوری کنید.

ج) به ازای هر 0 {0}} میکرولیتر IP lysate حاوی بازدارنده پروتئاز اضافه کنید.5-1 میلیون سلول (معادل یک چاه از یک 6-چاه صفحه). دمیدن مناسب و حمام یخ به مدت 3-5 دقیقه تا سلولها به طور کامل لیز شوند و پس از لیز شدن کامل نباید رسوب سلولی آشکاری وجود داشته باشد. اگر مقدار سلول ها بزرگتر باشد، توصیه می شود که سلول ها به 0.{6}} میلیون سلول/لوله تقسیم شوند تا کاملاً لیز شوند.

د) سانتریفیوژ در 12، 000 xg به مدت 5 دقیقه در 4 درجه، رسوب را دور بریزید و مایع رویی را برای آزمایش‌های بعدی ایمونوفیلاسیون یا رسوب ایمنی خارج کنید.

برای نمونه های سلولی معلق:

الف) سانتریفیوژ در 1،000 xg به مدت 5 دقیقه در 4 درجه برای جمع آوری رسوب. در صورت لزوم، یک بار با PBS بشویید، سپس مایع باقیمانده را آسپیره کنید و به آرامی ورتکس کنید تا سلول ها تا حد امکان پراکنده شوند.

ب) به ازای هر 0، {{0}} میکرولیتر IP lysate حاوی بازدارنده پروتئاز اضافه کنید.5-1 میلیون سلول (معادل یک چاه از یک 6-چاه صفحه). دمیدن مناسب و حمام یخ به مدت 3-5 دقیقه تا سلول ها به طور کامل لیز شوند. اگر مقدار سلول ها بزرگتر باشد، توصیه می شود که سلول ها به 0.{6}} میلیون سلول/لوله تقسیم شوند تا کاملاً لیز شوند.

ج) سانتریفیوژ در 12،000 xg به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه، رسوب را دور بریزید و مایع رویی را برای آزمایش‌های بعدی ایمونوفیلاسیون یا رسوب ایمنی خارج کنید.

برای نمونه های باکتریایی یا مخمر:

الف) 1 میلی لیتر محلول باکتریایی یا مخمری بردارید و سانتریفیوژ کنید تا مایع رویی خارج شود. در صورت لزوم، سلول ها را می توان یک بار با PBS شست و مایع باقی مانده را در آخرین بار کاملاً جذب کرد. به آرامی گرداب کنید تا سلول ها تا حد امکان پراکنده شوند.

ب) 100-200 میکرولیتر از IP lysate حاوی مهارکننده پروتئاز را اضافه کنید و به آرامی باد بزنید تا باکتری ها یا قارچ ها کاملاً پراکنده شوند.

ج) حمام یخ به مدت 10 دقیقه، برای لیز بهتر، باکتری ها و مخمرها را می توان به ترتیب با لیزوزیم و آنزیم دیوارشکن (خود تهیه شده) هضم کرد و سپس با لیز IP حاوی مهارکننده های پروتئاز لیز کرد.

د) سانتریفیوژ در 12، 000 xg به مدت 5 دقیقه در 4 درجه، رسوب را دور بریزید و مایع رویی را برای آزمایش‌های بعدی ایمونوفیلاسیون یا رسوب ایمنی خارج کنید.

3. آماده سازی آگاروز

الف) به آرامی دانه‌های A/G پروتئین سوئیآگارز را مجدداً معلق کنید تا تا آنجا که ممکن است یک پراکندگی دانه‌های همگن تشکیل شود، به ازای هر 500 میکرولیتر نمونه، 2{4}} ul از پراکندگی دانه‌های خوب مخلوط شده اضافه کنید، مقدار مناسبی از دانه‌های آگارز را بردارید. داخل یک لوله EP تمیز و 1 x TBS را به حجم نهایی 0.5 میلی لیتر (20 میکرولیتر مهره) اضافه کنید. پراکندگی برای هر نمونه در مراحل زیر به عنوان نمونه استفاده می شود.

ب) به آرامی مهره ها را دوباره معلق کنید، سانتریفیوژ کنید در 6،{1}}×g به مدت 30 ثانیه در 4 درجه، مایع رویی را با احتیاط خارج کنید و مراحل بالا را دو بار تکرار کنید.

ج) با توجه به حجم پراکندگی اولیه مهره ها با 1x TBS معلق شدند.

4. اتصال آنتی بادی به دانه های SweAgarose Protein A/G

الف) آماده سازی آنتی بادی: آنتی بادی را با 1x TBS رقیق کنید تا محلول کار آنتی بادی مطابق با نسبت رقت توصیه شده در دستورالعمل های آنتی بادی آماده شود، یا آنتی بادی را در محلول کاری آنتی بادی با غلظت نهایی 5-50 ug/mL آماده کنید. که می توان آن را روی یخ تهیه کرد; اختیاری: از IgG نرمال از همان گونه آنتی بادی برای تهیه محلول کاری IgG معمولی با نسبت رقت یکسان یا غلظت نهایی 5-50 ug/mL استفاده کنید، اتصال غیر اختصاصی را حذف کنید یا به عنوان کنترل منفی استفاده کنید. IgG طبیعی همان گونه بدین معنی است که اگر آنتی بادی مورد استفاده در رسوب ایمنی بعدی IgG موش باشد، مقدار مناسبی از IgG نرمال موش را می توان در این مرحله برای کاهش پس زمینه یا به عنوان یک کنترل منفی با TBS 1 برابر رقیق کرد.

ب) جذب آنتی بادی: دانه های SweAgarose Protein A/G تهیه شده در مرحله 3 را با سانتریفیوژ در دمای 6،{2}} xg برای 30 ثانیه در 4 درجه جدا کنید، مایع رویی را آسپیره کنید، 500 میکرولیتر محلول آنتی بادی یا محلول کار IgG معمولی اضافه کنید. ، دوباره معلق کنید و سپس به مدت 15-60 دقیقه در دمای اتاق روی مخلوط کن چرخشی انکوبه کنید.

توجه: همچنین می توان دانه های SweAgarose Protein A/G تهیه شده در مرحله 3 را مستقیماً با مقدار مناسب آنتی بادی یا IgG طبیعی انکوبه کرد.

ج) جداسازی و شستشوی دانه ها: دانه های انکوبه شده را با سانتریفیوژ در دمای 6، xg به مدت 30 ثانیه در 4 درجه جدا کنید، مایع رویی را آسپیره کنید، 500 میکرولیتر 1×TBS اضافه کنید، دانه های SweAgarose Protein A/G را به آرامی معلق کنید. دمیدن با پیپت، سانتریفیوژ در 6،{7}} xg به مدت 30 ثانیه در دمای 4 درجه، مایع رویی را خارج کرده، شستشو را سه بار تکرار کنید و دانه‌ها را با 1×TBS به همان میزان حجم اولیه معلق کنید.

نکته: اگر دانه ها در حین جوجه کشی و شستشو به صورت آگلومره یا پوسته پوسته شوند، یک پدیده طبیعی است و تاثیری بر نتایج آزمایشی نخواهد داشت.

5. رسوب ایمنی (IP):

الف) حذف اتصال غیر اختصاصی (اختیاری): دانه های SweAgarose Protein A/G تهیه شده در مرحله 4 که IgG معمولی را متصل می کند با نمونه ها در دمای 4 درجه به مدت 60 دقیقه انکوبه شده و با سانتریفیوژ در دمای 6 جدا می شوند. }} xg برای 30 ثانیه در 4 درجه، و مواد رویی برای آزمایش‌های بعدی استفاده می‌شوند. هدف از این مرحله حذف پروتئین هایی است که به طور غیر اختصاصی به IgG طبیعی متصل می شوند.

ب) جوجه کشی نمونه ها با دانه های SweAgarose Protein A/G کونژوگه با آنتی بادی یا IgG معمولی: دانه های SweAgarose Protein A/G کونژوگه شده با آنتی بادی یا IgG معمولی را به نسبت 20 ul سوسپانسیون مهره برای هر 500 ul نمونه پروتئین اضافه کنید. روی یک تکان دهنده نوسانی جانبی یا یک میکسر چرخشی و جوجه کشی کنید به مدت 2 ساعت در دمای اتاق یا یک شب در 4 درجه سانتیگراد.

نکته 1: اگر دانه ها در حین جوجه کشی و شستشو به صورت آگلومره یا پوسته پوسته شوند، پدیده ای طبیعی است و تاثیری بر نتایج آزمایشی نخواهد داشت.

نکته 2: همچنین می توان مقدار مناسب آنتی بادی یا IgG طبیعی را با نمونه به مدت 1-2 ساعت در دمای اتاق یا یک شب در دمای 4 درجه انکوبه کرد و سپس می توان 10-20 میکرولیتر سوسپانسیون دانه آگارز را اضافه کرد. و به مدت 60 دقیقه در دمای اتاق انکوبه می شود.

ج) سانتریفیوژ: پس از انکوباسیون، سانتریفیوژ را در 6،{1}} xg به مدت 30 ثانیه در 4 درجه انجام دهید تا مایع رویی خارج شود.

توجه: بخشی از مایع رویی را برای آزمایش اثر رسوب ایمنی نگه دارید.

د) شستشو: 500 ul 1×TBS اضافه کنید، دانه های معلق مجدد را به آرامی با پیپت باد کنید، سانتریفیوژ کنید در 6،{3}} xg به مدت 30 ثانیه در 4 درجه تا مایع رویی خارج شود و شستشو را سه بار تکرار کنید.

نکته: همچنین می‌توانید OD280 بافر شستشو را برای تعیین کامل بودن شستشو اندازه‌گیری کنید، اگر OD280 بیش از 0.05 باشد، تعداد دفعات شستشو باید به‌طور مناسب افزایش یابد.

6. شستشو

بسته به ویژگی های پروتئین هدف و نیازهای آزمایش های بعدی، می توان یکی از روش های زیر را برای شستشو انتخاب کرد.

a) روش شستشوی دناتوره کردن:نمونه های شسته شده با این روش برای SDS-PAGE مناسب هستند. 25 میکرولیتر از بافر نمونه برداری 1× پروتئین (کاهش شده) را پس از سانتریفیوژ به لوله اضافه کنید، به مدت 5 دقیقه در دمای 95 درجه حرارت دهید و سپس سانتریفیوژ کنید تا مایع رویی برای تشخیص وسترن بلات جمع آوری شود.

b) شستشوی اسیدی:نمونه شسته شده توسط این روش فعالیت بیولوژیکی اولیه خود را حفظ می کند و می تواند برای تجزیه و تحلیل پس از عملکرد استفاده شود. پس از سانتریفیوژ، 20 میکرولیتر از بافر شستشوی اسید را به لوله اضافه کنید، خوب مخلوط کنید و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید، سپس سانتریفیوژ کنید تا مایع رویی را در یک لوله EP جدید جمع آوری کنید، و بلافاصله 2 میکرولیتر از بافر شستشوی نئولیزاسیون برای تنظیم pH اضافه کنید. محصول شسته شده به حالت خنثی، که می تواند برای تجزیه و تحلیل پس از عملکرد استفاده شود.

توجه: کاربر می تواند مقدار بافر شستشوی اضافه شده را با توجه به حجم مورد نظر تنظیم کند.

1. SweAgarose Protein A/G را در کیت در درجه -20 نگهداری نکنید یا به طور مکرر منجمد و ذوب نکنید، در غیر این صورت عملکرد دانه های مغناطیسی را تحت تأثیر قرار داده و باعث خطاهای آزمایشی غیر ضروری می شود.

2. لطفاً این دستورالعمل ها را قبل از انجام روش ایمونوپسیتیشن به دقت بخوانید.

3. اگر پروتئین هدف ایمونو رسوب‌شده شامل فسفوریلاسیون یا اصلاح استیلاسیون باشد، باید مهارکننده‌های فسفاتاز مناسب و مهارکننده‌های داستیلاز تهیه شود.

4. دانه ها را در pH 6-8 نگه دارید، از سانتریفیوژ، خشک کردن یا انجماد با سرعت بالا خودداری کنید، که ممکن است باعث تجمع دانه ها شود.

5. دانه ها باید قبل از استفاده کاملاً مخلوط شوند، عملیات اختلاط باید ملایم باشد و نباید در معرض چرخش و تکان شدید قرار گیرند تا از دناتوره شدن آنتی بادی جلوگیری شود.

6. کنترل مثبت و منفی (SweAgarose Mouse IgG) در رسوب ایمنی توصیه می شود.

7. نمونه‌های پروتئینی باید در اسرع وقت پس از جمع‌آوری خالص شوند و همیشه در دمای 4 درجه یا در حمام یخ قرار داده شوند تا روند تخریب یا دناتوره شدن پروتئین کاهش یابد.

8. دانه های آگارز ممکن است هنگام استفاده با شستشوی اسیدی جمع شوند، که یک پدیده طبیعی است و تأثیری بر استفاده معمولی از دانه های مغناطیسی ندارد.

9. فقط برای استفاده تحقیقاتی. برای استفاده در روش های تشخیصی یا درمانی نیست.

10. از لباس های محافظ مناسب مانند لباس های آزمایشگاهی، عینک ایمنی و دستکش استفاده کنید.

11. ظرفیت اتصال پروتئین A و پروتئین G به آنتی بادی های منابع ژنریک و زیرگروه های مختلف در جدول I نشان داده شده است.

جدول 1

فقط برای استفاده تحقیقاتی برای استفاده در روش های تشخیصی یا درمانی نیست!

تگ های محبوب: کیت رسوب ایمنی (پروتئین a/g آگارز)، کیت رسوب ایمنی چین (پروتئین a/g آگارز) تولید کنندگان، تامین کنندگان، کارخانه