کیت رنگ آمیزی TRAP

اسید فسفاتاز مقاوم به تارتارات (TRAP) آنزیم امضا کننده استئوکلاست ها است که به طور خاص در استئوکلاست ها توزیع می شود. کیت رنگ آمیزی TRAP برای تجسم استئوکلاست ها در بافت ها استفاده می شود. اصل اساسی این است که در شرایط اسیدی حاوی اسید تارتاریک، ضد تارتاریک اسید فسفاتاز TRAP می تواند نفتول AS-BI فسفات را هیدرولیز کند و نفتول AS-BI حاصل به هگزازول-پاراروزانیلین متصل می شود تا یک ماده بورگوندی غیر محلول در آب را تشکیل دهد. سایت فعال شده با آنزیم در محل، که کروماتوگرافی و محلی سازی را متوجه می شود آنتی تارتاریک اسید فسفاتاز

اجزای اصلی محصول: اجزای اصلی بافر واکنش بافر اسید استیک و تارتارات سدیم پتاسیم با pH حدود 5 است.{1}}; محلول پاراروسانیلین، حاوی پاراروسانیلین؛ جزء اصلی محلول نیتریت سدیم نیتریت سدیم 4٪ است. محلول سوبسترای فسفات AS-BI، جزء اصلی 20 میلی گرم در میلی لیتر نفتول فسفات AS-BI است. پس از رنگ آمیزی با این محصول، TRAP در استئوکلاست ها بورگوندی و در سیتوپلاسم موضعی شد. با توجه به مقدار 300 میکرولیتر در هر نقطه بافت روی برش، کیت می تواند بیش از 50 رنگ آمیزی TRAP را انجام دهد.

حمل و نقل یخ مرطوب؛ در دمای 2-8 درجه نگهداری شود و از نور، که محلول سوبسترای فسفات AS-BI در درجه -20 نگهداری می‌شود، پرهیز کنید، با اعتبار 12 ماه.

مایع کار TRAP را آماده کنید:

(1) 50 میکرولیتر محلول پاراروسانیلین (G1050-2) و 50 میکرولیتر محلول نیتریت سدیم (G1050-3) را بردارید و آنها را در یک لوله سانتریفیوژ تمیز مخلوط کنید تا محلول هگزازول-پاراروسانیلین به دست آید.

(2) 100 میکرولیتر محلول سوبسترای فسفات AS-BI (G1050-4) را به 100 میکرولیتر محلول هگزازول-پاراروسانیلین در مرحله 1 اضافه کنید و چندین بار دمیده و آسپیره کنید تا به طور کامل.

(3) 1.8 میلی لیتر بافر واکنش (G1050-1) را جذب کنید و آن را به محلول مخلوط در مرحله 2 اضافه کنید کاملاً مخلوط کنید.

(4) مایع مخلوط در مرحله 3 از طریق یک فیلتر سوزنی (0.45 میکرومتر فیلم فیلتر جریان) فیلتر می شود تا مایع کار TRAP به دست آید.

توجه: محلول کار را حتماً به ترتیبی که قرار دارد تهیه کنید.حدود 200-300 میکرولیتر محلول کاری برای هر نقطه بافت مورد نیاز است که باید با توجه به مقدار مصرف تهیه شود و در صورت نیاز برای جلوگیری از ضایعات استفاده شود.

1. بخش های پارافین به آب موم زدایی می شوند و برای چند دقیقه در آب خالص شسته می شوند.

2. برش ها را در دایره قلم شیمیایی بافت (با مقدار معینی آب خالص برای جلوگیری از خشک شدن برش ها) در جعبه مرطوب قرار داده و با آب خالص در دمای 37 درجه به مدت 2 ساعت انکوبه کنید.

3. پس از انکوبه شدن بخش، آب خالص را بیرون بریزید، محلول کار TRAP صاف شده را برای پوشاندن بافت اضافه کنید و آن را در دمای 37 درجه در تاریکی به مدت 20-30 دقیقه قرار دهید.

4. (اختیاری، معرف های خود را آماده کنید) مقابله با هسته ها: محلول جوجه کشی را ریخته و با محلول رنگی هماتوکسیلین بشویید تا هسته ها لکه دار شوند.

5. آبگیری کنید، شفاف کنید و با آدامس خنثی ببندید.

1. تثبیت سلول: محیط کشت سلولی را با مکش خارج کنید، 4% پارافورمالدئید اضافه کنید.G1101 توصیه می شود) و به مدت 15-30 دقیقه ثابت کنید، سپس 3 بار با آب مقطر بشویید.

2. پارگی غشای سلولی: سلول ها با محلول 0.2% Triton X-100 به مدت 20-30 دقیقه پوشانده شدند و به آرامی با آب مقطر به مدت 3 بار شسته شدند.

3. جوجه کشی و رنگ آمیزی: محلول کار TRAP به صفحه چاه سلول اضافه شد تا سلول ها را بپوشاند و سلول ها در دمای 37 درجه به مدت 15-20 دقیقه در تاریکی انکوبه شدند و به مدت 3 بار با آب مقطر شسته شدند.

4. (اختیاری، معرف های خود را آماده کنید) ضد رنگ آمیزی هسته ای: محلول انکوباسیون را بلات کرده و با محلول رنگ آمیزی هماتوکسیلین برای رنگ آمیزی هسته ای بشویید.

5. مقدار مناسبی اتانول مطلق را برای کم آبی اضافه کنید، شیشه پوشش را در صفحه چاه بیرون بیاورید، آن را با سشوار خشک کنید و آن را به صورت وارونه روی لام شیشه تمیز با آدامس خنثی ببندید.

فقط برای استفاده تحقیقاتی!

تگ های محبوب: کیت رنگ آمیزی تله، تولید کنندگان کیت رنگ آمیزی تله چین، تامین کنندگان، کارخانه