معرفی محصول

نام محصول	گربه خیر	مشخصات
2× Fast SYBR Green qPCR Master Mix (ROX کم)	G3324-01	1 میلی لیتر
	G3324-05	5×1 میلی لیتر
	G3324-15	15×1 میلی لیتر

توضیحات محصول/معرفی

2× Fast SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) یک پیش مخلوط ویژه 2× برای واکنش qPCR با استفاده از روش فلورسانس کایمریک SYBR Green I است که شامل تمام اجزای qPCR به جز پرایمرها و قالب های DNA است که می تواند مراحل عملیات را کاهش دهد و زمان را کوتاه کند. افزودن نمونه ها و کاهش احتمال آلودگی جزء اصلی، مهندسی ژنتیکی استارت داغ Taq DNA Polymerase است که به طور موثری فعالیت DNA پلیمراز را مسدود می کند و با ترکیب موثر آنتی بادی مونوکلونال و Taq DNA پلیمراز، با مزایای بسیاری مانند ویژگی بالا و حساسیت بالا، از تقویت غیر اختصاصی در دماهای پایین جلوگیری می کند. و با یک بافر واکنش بهینه شده برای qPCR همراه است. برای واکنش qPCR با ویژگی بالا و حساسیت بالا بسیار مناسب است. این محصول یک معرف 2× پیش مخلوط حاوی غلظت بهینه SYBR Green I برای واکنش qPCR است که می تواند منحنی استاندارد خوبی را در یک منطقه کمی وسیع، کمی سازی دقیق ژن های هدف، تکرارپذیری خوب، اطمینان بالا و سریع ترین واکنش qPCR به دست آورد. می تواند در 30 دقیقه تکمیل شود.

شرایط نگهداری و حمل و نقل

حمل با یخ مرطوب. نگهداری در -20 درجه بدون نور، اعتبار به مدت 12 ماه. از چرخه های انجماد و ذوب خودداری کنید. پس از ذوب، می توان آن را به طور پایدار در دمای 4 درجه به مدت یک ماه بدون نور نگهداری کرد.

محتویات محصول

جزء	G3324-01	G3324-05	G3324-15
2×Fast SYBR Green qPCR Master Mix (ROX کم)	1 میلی لیتر	5×1 میلی لیتر	15×1 میلی لیتر
دستی	یک کپی

پروتکل / رویه های سنجش

قبل از شروع

1. ابزار تقویت زمان واقعی PCR.

2. لوله واکنش ویژه یا صفحه واکنش برای آزمایش.

3. پرایمرهای PCR (اصول طراحی پرایمر مرجع).

4. میکروپیپت و اتوکلاو-نوک.

رویه ها

1. سیستم واکنش PCR توصیه شده

جزء	20 میکرولیتر rxn	50 میکرولیتر rxn	غلظت نهایی
2×Fast SYBR Green qPCR Master Mix (ROX کم)	10 μL	25 μL	1×
پرایمر جلو (10 میکرومولار) a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
پرایمر معکوس (10 میکرومولار)a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
الگوب	متغیر	متغیر	همانطور که لازم است
آب بدون هسته	به 20 میکرولیتر اضافه کنید	به 50 میکرولیتر اضافه کنید

الف معمولاً با غلظت نهایی {0}}.2 میکرومولار می‌توان اثر تقویت خوبی به دست آورد. هنگامی که عملکرد واکنش ضعیف است، غلظت پرایمر را می توان در محدوده 0 تنظیم کرد.2-1.0 میکرومولار.

ب مقدار الگوی اضافه شده بسته به تعداد نسخه های ژن مورد نظر متفاوت است و مقدار مناسب افزودن الگو با رقت شیب بررسی می شود. بهترین مقدار افزودن DNA الگو در سیستم واکنش 20 میکرولیتری کمتر از 100 نانوگرم بود. هنگامی که cDNA (محلول واکنش RT) واکنش RT-PCR به عنوان الگو مورد استفاده قرار گرفت، مقدار اضافه نباید از 10٪ حجم نهایی qPCR تجاوز کند.

2. روش واکنش PCR (با توجه به ابزار قابل تنظیم است):

مرحله	مرحله	تعداد چرخه ها	دما	زمان
مرحله 1	پیش انحطاط	1	95 درجه	30 ثانیه
مرحله 2	انحطاط	40	95 درجه	3-10 بخش
مرحله 2	بازپخت - گسترش	40	60 درجه	10-30 ثانیه
مرحله 3	منحنی ذوب	1	تنظیمات پیش فرض ابزار

استفاده از روش سریع دستگاه PCR کمی فلورسنت با برند مربوطه ترجیحاً توصیه می شود و با روش استاندارد تقویت سازگار است. روش سریع برای اکثر ژن ها مناسب است و روش استاندارد را می توان برای برخی از ژن ها با ساختار ثانویه پیچیده امتحان کرد.

الف: الگوی ژنوم می تواند زمان پیش از انحطاط را تا 2-3 دقیقه طولانی کند.

ب: مرحله چرخه: زمان دناتوراسیون روش استاندارد 10 ثانیه است. اگر قطعه تقویت شده کمتر از 200 جفت باز باشد، کوتاه ترین گزینه برای روش سریع 3 ثانیه است.

c: مرحله چرخه: روش استاندارد زمان بازپخت / طویل شدن برای 30 ثانیه انتخاب شده است. اگر قطعه تقویت شده کمتر از 200 جفت باز باشد، کوتاه ترین روش می تواند به عنوان 10 ثانیه انتخاب شود. بیش از 200 جفت باز، انتخاب توصیه شده 30 ثانیه است. برای جمع آوری سیگنال فلورسانس، لطفاً رویه آزمایشی را مطابق دفترچه راهنمای دستگاه تنظیم کنید.

توجه داشته باشید

1. قبل از استفاده به آرامی به صورت وارونه مخلوط کنید. برای جلوگیری از ایجاد حباب از چرخاندن و تکان دادن خودداری کنید. قبل از استفاده معرف ها را به خوبی مخلوط کنید.

2. هنگام تهیه محلول واکنش، معرف ها باید روی یخ قرار گیرند.

3. محصول حاوی رنگ فلورسنت SYBR Green است، بنابراین هنگام تهیه محلول واکنش PCR باید از نور قوی اجتناب شود.

4. لطفا از سر یکبار مصرف جدید برای آماده سازی و بسته بندی محلول واکنش استفاده کنید تا از آلودگی بین نمونه ها جلوگیری شود.

5. از انجماد و ذوب مکرر مستر میکس خودداری کنید و سعی کنید تا یک ماه پس از ذوب از آن استفاده کنید.

ابزارهای سازگار

نام تجاری دستگاه PCR	G3323 (هیچ ROX)	G3324 (ROX کم)	G3325 (بالا ROX)
ABI ترمو زندگی	PikoRealTM Cycler	7500/7500 سریع، سری ViiA 7™ QuantStudio™	5700/7000/7300/7700/7900/ 7900HT٪2f7900 HT Fast٪2cStepOne٪e2٪84٪a2٪2cStepOne Plus٪e2٪84٪a2
استراتژین		Mx3000P٪c2٪ae٪2f3005P٪e2٪84٪a2٪2f4000٪e2٪84٪a2
بیو راد	همه سریال ها
اپندورف	Realplex 2s، Mastercycler®ep realplex
IIIumina	اکو QPCR
قیفاووس	SmartCycler٪c2٪ae
کیاگن کوربت	سری Rotor-Gene®
روشه	سری LightCycler™
تاکارا	سری Thermal Cycler Dice
تحلیلی	سری qTOWER
کیو تاور	سری لاین ژن

اصول طراحی پرایمر

1. طول محصول تقویت توصیه می شود بین 80-300 bp باشد.

2. طول آغازگر: 18-25 bp;

3. محتوای پایه G+C در پرایمرها باید بین 40%-60% باشد.

4. اختلاف مقدار Tm بین پرایمرهای فوروارد و معکوس کمتر از 2 درجه است و مقدار Tm بین 58-62 درجه بهترین است.

5. تصادفی بودن توزیع پایه;

6. پرایمرها بهتر است حاوی توالی های خود مکمل نباشند، در غیر این صورت یک ساختار سنجاق سر ثانویه را تشکیل می دهند.

7. بین دو پرایمر نباید بیش از 4 پایه مکمل یا همولوگ وجود داشته باشد، در غیر این صورت دایمر آغازگر تشکیل می شود، به خصوص همپوشانی مکمل در انتهای 3'.

8. پایه 3' انتهایی پرایمر G یا C پیشنهاد می شود.

9. هیچ محصول غیر اختصاصی دیگری در نتایج مقایسه NCBI یافت نشد.

عیب یابی

شرح مشکل	دلایل احتمالی	راه حل ها
در پایان واکنش، منحنی تقویت ظاهر نشد یا مقدار CT خیلی دیر ظاهر شد	غلظت الگو خیلی کم است	آزمایش را برای کاهش چند برابر رقت الگو تکرار کنید و زمانی که غلظت نمونه مشخص نیست از بالاترین غلظت شروع کنید
	تخریب الگو	قالب دوباره آماده شد و آزمایش تکرار شد
	مهارکننده های PCR در سیستم وجود دارد	به طور کلی، قالب در داخل حمل می شود، نسبت رقیق سازی قالب افزایش می یابد یا قالب با خلوص بالا دوباره آماده و تکرار می شود.
	پرایمرها ممکن است تخریب شوند	پرایمرهایی که برای مدت طولانی مورد استفاده قرار نگرفته اند، ابتدا باید از نظر یکپارچگی با الکتروفورز PAGE آزمایش شوند تا احتمال تخریب آن رد شود.
	راندمان تقویت پایین	غلظت پرایمر را افزایش دهید، روش تقویت سه مرحله ای را امتحان کنید یا پرایمر را دوباره طراحی کنید
	محصول تقویت بیش از حد طولانی است	طول محصول تقویت در محدوده 80-300 جفت باز کنترل شد
کنترل خالی سیگنال را نشان می دهد	آلودگی سیستم واکنش	ابتدا آب کنترل خالی باید تعویض شود. اگر باز هم همین وضعیت وجود داشت، پرایمرها، آسپیراتورها و لوله‌های PCR باید جایگزین شوند یا یک Master Mix جدید شروع شود. سیستم واکنش در یک جدول فوق العاده تمیز برای کاهش آلودگی آئروسل آماده شده است
کنترل خالی سیگنال را نشان می دهد	تقویت غیر اختصاصی مانند دایمرهای پرایمر ظاهر می شود	به طور کلی، طبیعی است که محصولات تقویت پس از 35 سیکل در کنترل خالی ظاهر شوند، که باید با منحنی ذوب آنالیز شود. پرایمر را دوباره طراحی کنید، غلظت پرایمر را تنظیم کنید یا روش واکنش PCR را بهینه کنید
منحنی ذوب چندین قله دارد	طراحی پرایمر ضعیف است	پرایمر جدید با توجه به اصول طراحی پرایمر دوباره طراحی شد
	غلظت پرایمر خیلی زیاد است	غلظت پرایمر را به طور مناسب کاهش دهید
	در قالب cDNA آلودگی ژنومی وجود دارد	محلول RNA استخراج شده با استفاده از آنزیم های DNA مانند dsDNase برای حذف آلودگی ژنومی یا طراحی آغازگرهای ترانس اینترون هضم می شود.
تکرارپذیری ضعیف آزمایش ها	خطای افزودن نمونه زیاد است	استفاده از پیپت دقیق، با پیپت دقیق سر مکش با کیفیت بالا. الگوی رقت بالا، اضافه کردن الگوی حجم زیاد برای کاهش خطای نمونه برداری. حجم واکنش qPCR بزرگ شد
	غلظت الگو خیلی کم است	آزمایش را تکرار کنید تا زمان رقیق شدن الگو را کاهش دهید
	انحراف دما در مکان های مختلف دستگاه qPCR	دستگاه qPCR را به طور منظم کالیبره کنید
منحنی تقویت صاف نیست	سیگنال فلورسانس بسیار ضعیف است، پس از اصلاح سیستم تولید می شود	اطمینان حاصل کنید که رنگ های از قبل مخلوط شده در Master Mix تخریب نمی شوند. برای جمع آوری مواد مصرفی qPCR بهتر، سیگنال فلورسنت را جایگزین کنید
منحنی تقویت می شکند یا می لغزد	غلظت الگو بیشتر بود و مقدار نقطه پایانی خط پایه بیشتر از مقدار CT بود	نقطه پایانی پایه (مقدار Ct -3) کاهش یافت و داده ها مجدداً تجزیه و تحلیل شدند
منحنی های تقویت تک تک ولز ناگهان به شدت کاهش یافت	در لوله واکنش حباب هایی وجود دارد	اطمینان حاصل کنید که MIX کاملاً حل شده است و به طور یکنواخت نچرخید و نوسان نکنید. پس از افزودن نمونه، حباب ها با سانتریفیوژ با الاستیک سبک حذف می شوند. زمان قبل از دناتوراسیون به 10 دقیقه افزایش یافت تا حباب ها حذف شوند