کیت رنگ آمیزی فلورسانس سبز غشای سلولی DiO

 

نام محصول	گربه خیر	مشخصات
کیت رنگ آمیزی فلورسانس سبز غشای سلولی DiO	G1704	100-1000 T

 

 

DiO، همچنین با نام‌های DiOC18(3)، 3-octadecyl-2-[3-(3-octadecyl-2(3H)-benzoxazol-2-ylidene نیز شناخته می‌شود. )-1-پروپن-1-یل]بنزوکسازول پرکلرات، با وزن مولکولی 881.72، یک کلاس از لیپوفیل، رنگ های دی آلکیل دی بوسیانین با زنجیره بلند، رنگ های فلورسنت، که معمولاً در برچسب گذاری غشای سلولی و سایر ساختارهای بیولوژیکی محلول در چربی استفاده می شود. پس از ورود به غشای سلولی، DiO می‌تواند به صورت جانبی منتشر شود و به تدریج کل غشای سلولی را رنگ آمیزی کند. پس از تحریک و توسط فیلترهای استاندارد FITC قابل تشخیص است. حداکثر طول موج تحریک DiO 484 نانومتر و حداکثر طول موج انتشار 501 نانومتر است. با توجه به ویژگی های DiO، می تواند سلول های زنده و همچنین سلول های ثابت را رنگ آمیزی کند. علاوه بر این. پروب‌های DiO عموماً روی زنده‌مانی سلول‌ها تأثیر نمی‌گذارند، بنابراین سلول‌های برچسب‌دار رو به جلو یا معکوس یا برخی از مواد (اگزوزوم) می‌توانند به عنوان تشخیص ردیاب استفاده شوند.

کیت رنگ‌آمیزی فلورسانس سبز غشای سلولی DiO حاوی پروب فلورسانس DiO و بافر رنگ‌آمیزی بهینه‌شده است که می‌تواند رنگ‌آمیزی غشای سلولی را سریع‌تر، فلورسانس روشن‌تر و پایدارتر کند.

 

 

کشتی با یخ خشک؛ ذخیره در -20 درجه در تاریکی، اعتبار به مدت 6 ماه.

 

 

شماره کامپوننت	جزء	G1704
G1704-1	پروب فلورسنت سبز غشای سلولی DiO	400 μL
G1704-2	بافر رنگ آمیزی	100 میلی لیتر
دستی		یک کپی

 

 

1. تهیه محلول کار رنگ آمیزی DiO:

پروب فلورسنت سبز غشای سلولی DiO را با بافر رنگ آمیزی به نسبت 1:250 مخلوط و رقیق کنید تا محلول کاری رنگ آمیزی DiO (آماده استفاده) تهیه شود. توجه داشته باشید که نسبت رقت کاوشگر DiO را می توان با توجه به موقعیت خاص در 1:{3}}:500 تنظیم کرد تا بهترین اثر رنگ‌آمیزی را به دست آورد.

2. رنگ آمیزی سلول های معلق زنده

2.1. سلول های معلق را در 500-1، 000×g در دمای اتاق به مدت 3-5 دقیقه سانتریفیوژ کنید، مایع رویی سلول را بردارید.

2.2. مقدار مناسبی از محلول کار رنگ‌آمیزی Dio را برای معلق کردن مجدد سلول‌ها به تراکم سلولی نهایی در 1-2×106 سلول در میلی‌لیتر اضافه کنید.

2.3. در دمای 37 درجه در تاریکی به مدت 5-20 دقیقه جوجه کشی کنید. زمان انکوباسیون بهینه برای سلول های مختلف متفاوت است. با 5 دقیقه شروع کنید و زمان انکوباسیون را بر اساس نتیجه نهایی رنگ آمیزی بهینه کنید.

2.4. در پایان انکوباسیون، در 500-1000 گرم به مدت 3-5 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ کنید و محلول رنگ‌آمیزی DiO را آسپیره کنید.

2.5. سلول ها با PBS از قبل گرم شده یا محیط کشت سلولی در دمای 37 درجه معلق شدند و در 500-1000 گرم به مدت 3-5 دقیقه سانتریفیوژ شدند تا مایع رویی خارج شود.

2.6. مرحله 2.5 را تکرار کنید.

2.7. با فلوسیتومتری مستقیماً یا با میکروسکوپ فلورسانس پس از انتقال سلول ها به صفحه چند چاهی، ظرف کشت سلولی یا اسلاید سلولی تشخیص داده می شود. دیو دارای حداکثر تحریک در 484 نانومتر و حداکثر انتشار در 501 نانومتر است.

3. رنگ آمیزی سلول های زنده چسبنده زنده (6-به عنوان مثال صفحه چاه):

3.1. سلول های چسبنده بذر در 6-صفحه چاهی با تراکم معین.

3.2. محیط کشت را بردارید و سلول ها را دو بار با PBS بشویید (توصیه G4202). 1 میلی لیتر محلول کار رنگ آمیزی Dio (صفحات چاهی با اندازه های دیگر، تنظیم شده در حد مناسب برای اطمینان از اینکه رنگ سلول ها را می پوشاند) اضافه کنید.

3.3. در دمای 37 درجه در تاریکی به مدت 5-20دقیقه جوجه کشی کنید. زمان انکوباسیون بهینه برای سلول های مختلف متفاوت است. با 5 دقیقه شروع کنید و زمان انکوباسیون را بر اساس نتیجه نهایی رنگ آمیزی بهینه کنید.

3.4. محلول کار رنگ آمیزی غشای سلولی را آسپیره کنید و سلولها را 1-2 بار با PBS یا محیط سلولی از قبل گرم شده بشویید.

3.5. محیط کشت سلولی از قبل گرم شده یا محیط سلولی را در دمای 37 درجه اضافه کنید و سلول ها را با میکروسکوپ فلورسانس شناسایی کنید. دیو دارای حداکثر تحریک در 484 نانومتر و حداکثر انتشار در 501 نانومتر است.

4. رنگ آمیزی سلول های چسبنده ثابت:

4.1. پیش پردازش نمونه:

برای سلول ها: محیط سلولی را بردارید و 1-2 بار با PBS بشویید. محلول ثابت پارافورمالدئید 4% (توصیه G1101) را به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق اضافه کنید. محلول ثابت را بردارید و 2-3 بار با PBS بشویید.

4.2. نفوذپذیری: 0 را اضافه کنید.1-0.5% تریتون-100 (تهیه شده با PBS) و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق نفوذ کرد. محلول نفوذپذیری را بردارید و 2-3 بار با PBS بشویید.

4.3. (اختیاری، برچسب گذاری ایمونوفلورسانس) با آنتی بادی ها مطابق پروتکل رنگ آمیزی ایمنی جوجه کشی کنید یا با رنگ های دیگر انکوبه کنید.

توجه: محلول مسدود کننده، رقیق کننده آنتی بادی و محلول شستشو برای رنگ آمیزی ایمنی نباید حاوی مواد شوینده باشد.

4.4. مقدار مناسبی از محلول کار رنگ‌آمیزی DiO را برای پوشش سلول‌ها اضافه کنید، در دمای 37 درجه دور از نور به مدت 5-20 دقیقه انکوبه کنید و محلول کار رنگ‌آمیزی DiO را آسپیره کنید. توصیه می شود که زمان رنگ آمیزی با نمونه سلول خاص تنظیم شود تا نتایج رنگ آمیزی بهینه به دست آید.

4.5. سلول ها 2-3 بار با PBS شسته شدند و سپس برای مشاهده زیر میکروسکوپ فلورسانس قرار گرفتند (سلول ها باید با مقدار مناسب PBS پوشانده شوند). DiO دارای حداکثر طول موج تحریک 484 نانومتر و حداکثر طول موج انتشار 501 نانومتر است.

5. برچسب زدن فلورسنت اگزوزوم ها:

5.1. رسوب اگزوزومی با مقدار مناسبی از محلول کاری رنگ‌آمیزی DiO معلق شد.

5.2. در دمای 37 درجه به مدت 30 دقیقه در تاریکی انکوبه کنید.

5.3. (اختیاری) نمونه را با حجم 10- برابر PBS رقیق کنید.

5.4. اگزوزوم ها را دوباره طبق پروتکل استخراج قبلی برای حذف رنگ های اضافی استخراج کرد.

5.5. رسوب اگزوزوم ها را جمع آوری کنید و مجدداً در PBS معلق کنید تا اگزوزوم های دارای برچسب DIO را بدست آورید. می توان از آن برای آزمایش های بعدی مانند جذب سلولی استفاده کرد.

 

 

1. همه رنگ های فلورسنت دارای مشکلات خاموش شدن هستند، لطفاً در طول عملیات از نور محافظت کنید تا خاموش کردن فلورسانس را کاهش دهید.

2. با توجه به اینکه پروب چربی دوست است، لطفا از استفاده از معرف های حاوی گلیسیرین یا سایر مواد آلی خودداری کنید.

3. در صورت نیاز به تثبیت، توصیه می کنیم در 4% پارافورمالدئید تثبیت شود. سایر راه حل های اصلاح نامناسب منجر به پس زمینه فلورسانس بالا می شود.

4. نسبت رقت بهینه و زمان انکوباسیون پروب باید بر اساس وضعیت واقعی به دلیل حساسیت متفاوت بین سلول ها و نیاز تجربی تنظیم شود.

5. برای ایمنی و سلامتی خود، لطفاً از عینک ایمنی، دستکش یا لباس محافظ استفاده کنید.

 

فقط برای استفاده تحقیقاتی!

 

 

تگ های محبوب: کیت رنگ آمیزی فلورسانس سبز غشای سلولی دیو، تولید کنندگان کیت رنگ آمیزی فلورسانس سبز غشای سلول دیو سلولی، تولید کنندگان، کارخانه